Точность молекулярной диагностики методом пцр

Точность молекулярной диагностики методом пцр

Переезд склада в Европу.
Реализуем препараты от гепатита С в России по закупочной цене - ликвидация склада
Перейти на сайт

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований[9].

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

1-ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

2-Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

3-Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.

4- Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Taq-полимераз/Pfu-полимераза/Pwo-полимераза/Tth-полимераза и другие.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Преимущества ПЦР:

Высокая чувствительность

Высокая специфичность

Простота в исполнении

Скорость

Компоненты реакции:

Праймеры

ДНК-полимераза

Смесь нуклеотидов

Дезоксинуклеотидтрифосфатов:

АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ

Буферный раствор

Анализируемый образец ДНК

Принципы ПЦР:

Использование термостабильной полимеразы

Полимераза достраивает специфические затравки

Амплификацию проводят в течении 30-40 циклов

За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого фрагмента ДНК в более чем 1млн раз.

Вопрос-99 Электрофарез

Лекарственный электрофорез Механизм действия этой процедуры заключается в том, что лекарственный препарат в виде ионов поступает внутрь организма пациента через поры и протоки сальных и потовых желез. Катионы и анионы задерживаются на кожных покровах под электродом, а затем постепенно проникают в кровь и лимфу. Из-за такого постепенного поступления воздействие лекарства на организм длительное, что является одним из преимуществ этого метода терапии. Осуществляется лекарственный электрофорез при помощи разных аппаратов, одним из которых является «Поток». Этот прибор в медицине используется уже давно, он проверен временем и надежен. Есть возможность регулировать во время процедуры силу тока, а также устанавливать время. В настоящее время выпускаются современные аналоги прибора, которые имеют цифровые индикаторы. Чтобы получить терапевтический эффект, совсем необязательно располагать электроды на больном органе или вводить большие дозы препаратов. Посредством физиотерапии вводят ионы кальция, магния, йода для повышения рефлекторного воздействия на пораженную ткань.

Методики проведения электрофореза

Чтобы повысить эффективность данной процедуры, постоянно разрабатываются и совершенствуются методики электрофореза лекарственного. В настоящее время используют следующие:

Пролонгированная гальванизация. Применяют электрический ток малой силы, но время воздействия продолжительное. Батарея «Крона» является источником тока. Курс лечебных процедур обычно составляет 20-30 сеансов. Электрофорез хорошо успокаивает, оказывает обезболивающее действие.

Лабильная гальванизация.Один электрод во время процедуры закрепляется неподвижно, а второй находится в движении и перемещается со скоростью 3-5 см в секунду по поверхности кожи. Чтобы исключить колебания тока, в аппарат вводят стабилизирующее устройство. Процедура хорошо повышает метаболизм, улучшает кровоснабжение органов и тканей и нервно-мышечную проводимость.

 Внутритканевый электрофорез. Проведение процедуры лекарственного электрофореза по данной методике сводится к введению через канюлю подкожно или внутримышечно препарата или смеси веществ. Вводиться лекарство может струйно или капельно. К очагу поражения поперек накладывают электроды, чтобы увеличить концентрацию медицинского препарата. Если лекарство вводят струйно, то ток включают одновременно с этим, а при капельном — после введения.

Вопрос-100 Блот гибридизации

Блот-гибридизация — гибридизация рестриктазных фрагментов исследуемой ДНК, предварительно разделенных электрофоретически и перенесенных на нитроцеллюлозный фильтр при помощи фильтровальной бумаги, со специфичным нуклеотидным зондом. Методика проведения Б.-г. состоит из нескольких этапов.

1-й этап — получение ДНК из исследуемого материала. В зависимости от вида биологического материала (ткань, кровь, молоко) методика выделения ДНК имеет специфические особенности. Главным моментом на данном этапе является депротеинизация ДНК, ее отделение от белка, осаждение и отмывание.

 2-й этап— обработка ДНК рестриктазами (рестрикционными эндонуклеазами). Обработка происходит в стандартных условиях на протяжении 3-16 ч. Вследствие гидролиза длинноцепочечная ДНК превращается в смесь коротких фрагментов.

3-й этап — нанесение смеси фрагментов ДНК на электрофоретическую пластинку агарозным гелем и проведение электрофореза.Вследствие различной молекулярной массы фрагменты ДНК будут двигаться в электрическом поле от отрицательного полюса к положительному с различной скоростью.После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.

 4-й этап— непосредственно блоттинг, или получение оттиска картины электрофореза на нитроцеллюлозном фильтре. Сразу после окончания электрофореза на пластинку агарозного геля, которая находится в буферном растворе, накладывают нитроцеллюлозный фильтр, а сверху на него — несколько листов фильтровальной бумаги, и все это помещают под пресс. За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля, который вместе с ДНК-рестриктами проходит через нитроцеллюлозный фильтр. ДНК-фрагменты адсорбируются на фильтре строго в соответствии с их положением в геле. Таким способом получают от печаток полученных рестриктов на нитроцеллюлозном фильтре. Помимо нитроцеллюлозных фильтров используются различные нейлоновые или капроновые мембраны. Нейлоновые мембраны ковалентно связывают ДНК-фрагменты, что позволяет осуществлять их последующую регенерацию и многократное использование. Для ускорения процедуры блоттинга и его эффективности применяют вакуум и электроперенос.

5-й этап — гибридизация рестриктных фрагментов с ДНК-зондами. ДНК-цепи закрепляют на фильтре прогреванием, а далее фильтр инкубируется с меченым нуклеотидным зондом. В качестве метки в классическом варианте используют изотопные маркеры, чаще 32Р. В таком случае дальнейшая идентификация гибридов производится путем радиоавтографии. Различают несколько видов блот-гибридизации: Саузерн-блоттинг(см.) — для визуализации фрагментов ДНК; нозерн-блоттинг (см.) — для РНК; вестернблоттинг, или иммуноблоттинг, — для связывания электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с мечеными антителами.

 

 

 



Источник: studopedia.net


Добавить комментарий